تفاوت‌های کلیدی در طراحی پرایمر برای qRT-PCR بین ژن‌های انسانی و گیاهی عمدتاً ناشی از پیچیدگی ژنوم گیاهی، تنوع ژن‌های مرجع، و ملاحظات فنی خاص است. در ادامه این تفاوت‌ها به‌طور جامع بررسی می‌شوند:
🔍 1. چالش‌های ژنومی و توالی‌یابی
- ژنوم پلی‌پلوئید در گیاهان: بسیاری از گیاهان (مانند Rosa praelucens با ۱۰n=70) ژنوم‌های پلی‌پلوئید دارند که منجر به وجود ایزوفرم‌های ژنی همولوگ می‌شود. طراحی پرایمر در این موارد نیاز به شناسایی تک‌نوکلئوتید پلی‌مورفیسم‌ها (SNPs) برای تمایز بین ایزوفرم‌ها دارد. در حالی که ژنوم انسانی دیپلوئید (۲n=46) و کم‌تنوع‌تر است
- توالی‌های تکراری: ژنوم گیاهان حاوی توالی‌های تکراری فراوان (مانند ترانسپوزون‌ها) است که خطر اتصال غیراختصاصی پرایمر را افزایش می‌دهد. برای کاهش این خطر، ابزارهای in silico مانند BLAST علیه کل ژنوم گیاهی ضروری هستند 13.
- دسترسی به داده‌های ژنومی: ژنوم‌های گیاهی اغلب کامل‌ترتیب‌یابی نشده یا حاوی گپ‌های توالی‌یابی هستند، بنابراین طراحی پرایمر باید بر اساس داده‌های ترنسکریپتومی (ESTها یا RNA-Seq) انجام شود. در انسان، ژنوم‌های مرجع کاملی (مانند GRCh38) موجودند.
🧬 2. انتخاب ژن‌های مرجع (Reference Genes)
- پایداری متغیر در گیاهان: ژن‌های مرجع رایج در انسان (مانند GAPDH، ACTB) اغلب در گیاهان تحت تأثیر شرایط آزمایشی (نور، دما، بافت) ناپایدار هستند. برای مثال:
- در Eucommia ulmoides، ژن‌های UBC و UBC E2 برای بافت‌های مختلف پایدارند، اما 18S rRNA ناپایدار است 4.
- در توت‌فرنگی (Fragaria × ananassa)، HISTH4 و DBP پایدارترین ژن‌های مرجع تحت استرس دمایی هستند 14.
- نیاز به اعتبارسنجی چندژنی: در گیاهان معمولاً ترکیبی از ≥۲ ژن مرجع (مانند EEF1α + UBC) برای نرمال‌سازی دقیق توصیه می‌شود. در انسان، یک ژن مرجع غالباً کافی است .
- تفاوت در مسیرهای متابولیک: ژن‌های مرتبط با سنتز فلاونوئید یا پاسخ به استرس در گیاهان ممکن است به‌عنوان مرجع نامناسب باشند، در حالی که ژن‌های housekeeping انسان عمدتاً در مسیرهای پایه سلولی (مثل سیتواسکلتون) مشارکت دارند .
⚙️ 3. ملاحظات فنی در طراحی پرایمر
- طول محصول PCR: در qRT-PCR گیاهی، طول بهینه محصول ۷۰–۲۰۰ جفت باز است تا از تاثیر ساختارهای ثانویه mRNAهای گیاهی جلوگیری شود. در انسان، این محدوده ۱۰۰–۱۵۰ جفت باز است.
- ساختارهای ثانویه: mRNAهای گیاهی اغلب ساختارهای ثانویه پایدار (مانند stem-loop) تشکیل می‌دهند که اتصال پرایمر را مختل می‌کند. ابزارهایی مانند OligoAnalyzer برای پیش‌بینی این ساختارها ضروری‌اند .
- گیره GC (GC Clamp): در گیاهان، وجود ۲–۳ باز G/C در انتهای ′۳ پرایمر برای پایداری اتصال به‌دلیل محتوای GC متغیر ژنوم‌های گیاهی حیاتی است. در انسان، این نیاز کمتر است .
- دمای اتصال (Annealing Temperature): به‌دلیل تنوع بیشتر در توالی‌های گیاهی، اختلاف دمای ذوب (Tm) بین پرایمرهای فوروارد و ریورس باید ≤۳°C باشد (در انسان ≤۵°C قابل قبول است) .
🧪 4. اعتبارسنجی تجربی
- کارایی تکثیر (Amplification Efficiency):
- در گیاهان، بازه مطلوب کارایی ۹۰–۱۱۰٪ (با ضریب همبستگی R² > 0.99) است. برای ژن‌های همولوگ، کارایی باید با رقت‌های سریالی cDNA تأیید شود
- در انسان، کارایی ۹۵–۱۰۵٪ کافی است.
- تست اختصاصیت:
- در گیاهان، الکتروفورز محصول PCR و منحنی ذوب (Melting Curve) برای اطمینان از نبود باندهای غیراختصاصی ضروری است. در انسان، اغلب تنها منحنی ذوب کافی است .
📊 جدول مقایسه تفاوت‌های کلیدی
| پارامتر | گیاهان | انسان |
|---|---|---|
| پیچیدگی ژنوم | پلی‌پلوئید، ایزوفرم‌های همولوگ | دیپلوئید، ژنوم استاندارد |
| ژن‌های مرجع پایدار | UBC, EEF1α, HISTH4 | GAPDH, ACTB, 18S rRNA |
| تعداد ژن‌های مرجع | ≥۲ ژن | معمولاً ۱ ژن |
| طول محصول بهینه | ۷۰–۲۰۰ جفت باز | ۱۰۰–۱۵۰ جفت باز |
| نیاز به GC Clamp | ضروری (۲–۳ باز G/C در ′۳) | اختیاری |
| اختلاف مجاز Tm | ≤۳°C | ≤۵°C |
⚠️ 5. ملاحظات خاص برای گیاهان
- تأثیر القاکننده‌ها: در مطالعات پاسخ به استرس (شوری، خشکی)، ژن‌های مرجع باید تحت تیمارهای اکسوژن (مثل متیل‌جاسمونات) اعتبارسنجی شوند .
- تفاوت بافتی: بیان ژن‌های مرجع در بافت‌های گیاهی (ریشه، گل، میوه) بسیار متغیر است. برای مثال در Cichorium intybus، TIP41 برای کشت سلولی و Clath برای نهال‌ها مناسب‌اند .
- بهینه‌سازی دمای اتصال: به‌دلیل حضور متابولیت‌های ثانویه (مانند پلی‌فنول‌ها) در عصاره‌های گیاهی، بهینه‌سازی Ta با گرادیان دمایی ضروری است .
💎 نتیجه‌گیری
طراحی پرایمر qRT-PCR در گیاهان نیازمند:
- شناسایی دقیق ایزوفرم‌ها از طریق داده‌های ترنسکریپتومی.
- اعتبارسنجی چندژنی برای ژن‌های مرجع تحت شرایط آزمایشی خاص.
- رعایت الزامات فنی مانند GC Clamp و محدوده طول محصول.
- بهینه‌سازی تجربی دمای اتصال و کارایی تکثیر.
در مقابل، طراحی پرایمر برای ژن‌های انسانی با اتکا بر ژنوم‌های مرجع استاندارد و ژن‌های خانه‌نگهدار پایدار، ساده‌تر است. استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی مانند Primer-BLAST (با پایگاه‌داده‌های گیاهی) و geNorm برای تحلیل پایداری ژن مرجع، برای مطالعات گیاهی حیاتی است
