رایان زیست آریا

در طراحی پرایمر، **تعداد mismatch (ناسازگاری) مجاز کاملاً به موقعیت و هدف طراحی بستگی دارد، اما به طور کلی میتوان اینگونه خلاصه کرد:  

 🔬 قوانین کلیدی:
1. **انتهای ′3 پرایمر (بسیار حیاتی!)**  
  - **حداکثر ۰ mismatch** توصیه میشود.  
  - حتی **۱ mismatch در ۳-۲ نوکلئوتید انتهایی** میتواند اتصال پلیمراز را مختل کرده و PCR را کاملاً شکست دهد.  
  - *استثنا:* در تکنیکهایی مثل **ARMS-PCR** برای تشخیص SNP، یک mismatch عمدی در انتهای ′۳ ایجاد میشود تا اتصال آلل خاصی مسدود شود.

ادامه

2. **منطقه میانی پرایمر (انعطافپذیرتر)**  
  - **۱ تا ۳ mismatch** قابل تحمل است، اما:  
    - هر mismatch دمای ذوب (Tm) را **~۲-۵°C کاهش میدهد**.  
    - پرایمر باید همچنان Tm کافی (معمولاً >۵۵°C) داشته باشد.  
    - احتمال اتصال غیراختصاصی افزایش مییابد.

3. **انتهای ′۵ (کمترین حساسیت)**  
  - تا **۵-۶ mismatch** قابل تحمل است (مثلاً برای اضافه کردن سایت برش آنزیمی یا تگ).  
  - این منطقه در شروع اتصال پلیمراز نقش ندارد.  

 ⚠️ عوامل تأثیرگذار:
- **نوع PCR**:  
 - PCR استاندارد: کمترین mismatch بهتر است.  
 - **پرایمرهای دژنره** (Degenerate): چندین mismatch برنامه ریزی شده مجازند (مثلاً برای ژنهای هم خانواده).  
- **طول پرایمر**: پرایمرهای کوتاهتر (<۲۰bp) به mismatch حساس ترند.  
- **ترکیب بازها**:  
 - Mismatchهای **G-T** تحم لپذیرتر از **A-C** هستند.  
 - مناطق غنی از **GC** پایداری بیشتری دارند.  
- **غلظت منیزیم و دمای اتصال (Annealing)**: بهینه سازی این پارامترها میتواند تحمل mismatch را افزایش دهد.  

 🧪 راهکارهای طراحی:
- از نرم افزارهایی مثل **Primer-BLAST**, **OligoCalc** یا **SnapGene** برای پیشبینی اثر mismatch استفاده کنید.  
- در کاربردهای حساس (مثلاً **qPCR**)، به **صفر mismatch** در کل پرایمر پایبند باشید.  
- برای پرایمرهای دژنره، محدوده mismatch را به صورت **IUPAC codes** (مثل R = A/G) تعریف کنید.  

 ❌ عواقب mismatch بیشازحد:
- کاهش بازده PCR  
- اتصال غیراختصاصی و باندهای کاذب  
- عدم تکثیر محصول موردنظر  

✅ **جمع بندی:**  
- **ایده آل**: ۰ mismatch در کل پرایمر (به ویژه انتهای ′۳).  
- **عملی**: ۱-۲ mismatch در مناطق میانی با تنظیم شرایط PCR قابل پذیرش است.  
- هرگز در **۳ نوکلئوتید انتهایی** mismatch مجاز نیست، مگر برای اهداف خاص (مثل تشخیص SNP).  

برای پروژههای دقیق، همیشه پرایمر را با توالی هدف در پایگاههای داده (مثل NCBI BLAST) تأیید کنید تا از اختصاصی بودن آن مطمئن شوید!